L'histoire du jeu se déroule neuf mois après les évènements concluant Arkham City et la mort du Joker, dont la crémation sert de séquence d'ouverture. La cité de Gotham connaît alors une ère de paix et la criminalité est au plus bas. Cependant, le docteur Jonathan Crane, alias l’Épouvantail, présumé mort dans le premier opus, réapparaît et menace d'inonder la ville de son gaz. La police est alors contrainte d'abandonner la ville et d'évacuer la population en 24 heures. Profitant de l'instabilité environnante, les plus grands criminels de Gotham encore en vie (tels Double-Face, L'homme mystere, Harley Quinn et le Pingouin) s'allient pour prendre le contrôle de la cité, alors divisée en quartiers sous leur propre contrôle.

Après une brève rencontre avec Gordon sur le toit du GCPD, Batman commence sa traque de l'Épouvantail. Il retrouve Poison Ivy, tenue en secret par le docteur Crane après avoir refusé de se joindre à la coalition, n'ayant que peu d'intérêt à le suivre et parce qu'elle est immunisée contre la toxine. Guidé par Oracle, Batman pirate les antennes des studios de cinéma Panessa et de Falcone Shipping, et localise ainsi l'Épouvantail à l'usine chimique Ace Chemicals. Sur place, il découvre toute une armée, dirigée par le Chevalier d'Arkham, un mystérieux mercenaire qui semble le connaître et veut se venger de lui. Le docteur Crane projette de faire exploser une bombe capable de propager sa toxine sur toute la côte Est ; Batman parvient à réduire la puissance de la bombe, mais il respire le terrible poison, et laisse s'échapper l'Épouvantail. Quant au Chevalier d'Arkham, il lance toutes ses forces dans Gotham et enlève Oracle.